Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) είναι μία από τις μακροχρόνιες εκφυλιστικές παθήσεις των αρθρώσεων των οστών που επηρεάζει τον ηλικιωμένο πληθυσμό άνω των 65 ετών.
1]. Γενικά, οι ασθενείς με ΟΑ διαγιγνώσκονται με κατεστραμμένο χόνδρο, φλεγμονή του αρθρικού υμένα και διαβρωμένα χονδροκύτταρα, τα οποία προκαλούν πόνο και σωματική δυσφορία.
2]. Ο αρθριτικός πόνος προκαλείται κυρίως από τον εκφυλισμό του χόνδρου στις αρθρώσεις από φλεγμονή και όταν ο χόνδρος έχει υποστεί σοβαρή βλάβη τα οστά μπορούν να συγκρουστούν μεταξύ τους προκαλώντας αφόρητο πόνο και σωματική δυσκολία.
3]. Η συμμετοχή φλεγμονωδών μεσολαβητών με συμπτώματα όπως πόνος, οίδημα και δυσκαμψία της άρθρωσης είναι καλά τεκμηριωμένη. Σε ασθενείς με ΟΑ, οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες, οι οποίες προκαλούν τη διάβρωση του χόνδρου και του υποχόνδριου οστού, βρίσκονται στο αρθρικό υγρό.
4]. Δύο κύρια παράπονα που έχουν γενικά οι ασθενείς με ΟΑ είναι ο πόνος και η αρθρική φλεγμονή. Επομένως, οι πρωταρχικοί στόχοι των τρεχουσών θεραπειών ΟΑ είναι η μείωση του πόνου και της φλεγμονής. [
5]. Αν και οι διαθέσιμες θεραπείες για την ΟΑ, συμπεριλαμβανομένων των μη στεροειδών και στεροειδών φαρμάκων, έχουν αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα στην ανακούφιση του πόνου και της φλεγμονής, οι μακροχρόνιες χρήσεις αυτών των φαρμάκων έχουν σοβαρές συνέπειες για την υγεία, όπως καρδιαγγειακές, γαστρεντερικές και νεφρικές δυσλειτουργίες.
6]. Επομένως, πρέπει να αναπτυχθεί ένα πιο αποτελεσματικό φάρμακο με λιγότερες παρενέργειες για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας.
Τα φυσικά προϊόντα υγείας γίνονται όλο και πιο δημοφιλή επειδή είναι ασφαλή και εύκολα διαθέσιμα [
7]. Τα παραδοσιακά κορεάτικα φάρμακα έχουν αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα έναντι πολλών φλεγμονωδών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της αρθρίτιδας [
8]. Aucklandia lappa DC. είναι γνωστό για τις φαρμακευτικές του ιδιότητες, όπως η ενίσχυση της κυκλοφορίας του τσι για την ανακούφιση του πόνου και την καταπραϋντική του στομάχου, και έχει χρησιμοποιηθεί παραδοσιακά ως φυσικό αναλγητικό [
9]. Προηγούμενες αναφορές υποδηλώνουν ότι το A. lappa διαθέτει αντιφλεγμονώδη [
10,
11], αναλγητικό [
12], αντικαρκινικό [
13] και γαστροπροστατευτικό [
14] εφέ. Οι διάφορες βιολογικές δραστηριότητες του A. lappa προκαλούνται από τις κύριες δραστικές ενώσεις του: κοστουνολίδη, λακτόνη dehydrocostus, διυδροκοστουνολίδη, κουστουλακτόνη, α-κοστόλη, λακτόνη saussurea και κοστουσλακτόνη [
15]. Προηγούμενες μελέτες υποστηρίζουν ότι η κοστουνολίδη έδειξε αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS), ο οποίος επήγαγε τα μακροφάγα μέσω της ρύθμισης του μονοπατιού της πρωτεΐνης NF-kB και θερμικού σοκ [
16,
17]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει διερευνήσει τις πιθανές δραστηριότητες του A. lappa για τη θεραπεία της ΟΑ. Η παρούσα έρευνα έχει διερευνήσει τις θεραπευτικές επιδράσεις του A. lappa έναντι της ΟΑ χρησιμοποιώντας μοντέλα τρωκτικών που προκαλούνται από (μονοσάτριο-ιωδοοξικό) MIA και οξικό οξύ.
Το μονονάτριο-ιωδοοξικό (MIA) χρησιμοποιείται ευρέως για να προκαλέσει πολλές από τις συμπεριφορές πόνου και τα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά της ΟΑ στα ζώα [
18,
19,
20]. Όταν εγχέεται στις αρθρώσεις του γόνατος, το MIA διαταράσσει τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων και προκαλεί φλεγμονή και φλεγμονώδη συμπτώματα, όπως διάβρωση χόνδρου και υποχόνδριου οστού, τα βασικά συμπτώματα της ΟΑ.
18]. Η απόκριση σύσπασης που προκαλείται με οξικό οξύ θεωρείται ευρέως ως η προσομοίωση του περιφερικού πόνου σε ζώα όπου ο φλεγμονώδης πόνος μπορεί να μετρηθεί ποσοτικά.
19]. Η κυτταρική σειρά μακροφάγων ποντικού, RAW264.7, χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη των κυτταρικών αποκρίσεων στη φλεγμονή. Κατά την ενεργοποίηση με LPS, τα μακροφάγα RAW264 ενεργοποιούν φλεγμονώδεις οδούς και εκκρίνουν αρκετούς φλεγμονώδεις ενδιάμεσους, όπως TNF-α, COX-2, IL-1β, iNOS και IL-6 [
20]. Αυτή η μελέτη έχει αξιολογήσει τις αντι-αλγικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις του A. lappa έναντι της ΟΑ σε ζωικό μοντέλο MIA, ζωικό μοντέλο που προκαλείται από οξικό οξύ και κύτταρα RAW264.7 που ενεργοποιούνται από LPS.
2. Υλικά και Μέθοδοι
2.1. Φυτικό Υλικό
Η αποξηραμένη ρίζα του A. lappa DC. που χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα προμηθεύτηκε από την Epulip Pharmaceutical Co., Ltd., (Σεούλ, Κορέα). Ταυτοποιήθηκε από τον καθηγητή Donghun Lee, Τμήμα Φαρμακολογίας Βοτάνων, Συνταγματάρχη Κορεατικής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Gachon, και ο αριθμός δείγματος του κουπονιού κατατέθηκε ως 18060301.
2.2. HPLC Ανάλυση εκχυλίσματος A. lappa
Το Α. lappa εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή αναρροής (απεσταγμένο νερό, 3 ώρες στους 100°C). Το εκχυλισμένο διάλυμα διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας έναν εξατμιστή χαμηλής πίεσης. Το εκχύλισμα A. lappa είχε απόδοση 44,69% μετά από ξήρανση με ψύξη στους -80 °C. Η χρωματογραφική ανάλυση του A. lappa διεξήχθη με HPLC συνδεδεμένο χρησιμοποιώντας σύστημα HPLC 1260 InfinityⅡ (Agilent, Pal Alto, CA, USA). Για χρωματικό διαχωρισμό, χρησιμοποιήθηκε στήλη EclipseXDB C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm, Agilent) στους 35 °C. Συνολικά 100 mg του δείγματος αραιώθηκαν σε 10 mL μεθανόλης 50% και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά. Τα δείγματα διηθήθηκαν με φίλτρο σύριγγας (Waters Corp., Milford, MA, ΗΠΑ) 0,45 μm. Η σύνθεση κινητής φάσης ήταν 0,1% φωσφορικό οξύ (Α) και ακετονιτρίλιο (Β) και η στήλη εκλούστηκε ως εξής: 0-60 λεπτά, 0%. 60–65 λεπτά, 100%; 65–67 λεπτά, 100%; 67–72 λεπτά, 0% διαλύτης Β με ταχύτητα ροής 1,0 mL/min. Η εκροή παρατηρήθηκε στα 210 nm χρησιμοποιώντας όγκο έγχυσης 10 μL. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.
2.3. Στέγαση και Διαχείριση Ζώων
Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) ηλικίας 5 εβδομάδων και αρσενικοί ποντικοί ICR ηλικίας 6 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Κορέα). Τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα δωμάτιο χρησιμοποιώντας σταθερή θερμοκρασία (22 ± 2 °C) και υγρασία (55 ± 10%) και κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών. Τα ζώα εξοικειώθηκαν με την κατάσταση για περισσότερο από μία εβδομάδα πριν ξεκινήσει το πείραμα. Τα ζώα είχαν κατά βούληση παροχή τροφής και νερού. Οι ισχύοντες ηθικοί κανόνες για τη φροντίδα και το χειρισμό των ζώων στο Πανεπιστήμιο Gachon (GIACUC-R2019003) τηρήθηκαν αυστηρά σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες σε ζώα. Η μελέτη σχεδιάστηκε με τυφλή και παράλληλη δοκιμή ερευνητή. Ακολουθήσαμε τη μέθοδο της ευθανασίας σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Πειραματικής Δεοντολογίας σε Ζώα.
2.4. MIA Ένεση και Θεραπεία
Οι αρουραίοι διαχωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες, συγκεκριμένα εικονική, μάρτυρα, ινδομεθακίνη και Α. lappa. Έχοντας αναισθητοποιηθεί με 2% μίγμα ισοφθορανίου O2, οι αρουραίοι εγχύθηκαν χρησιμοποιώντας 50 μL MIA (40 mg/m, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) ενδοαρθρικά στις αρθρώσεις του γόνατος για να οδηγήσουν σε πειραματική ΟΑ. Οι θεραπείες διεξήχθησαν ως εξής: οι ομάδες ελέγχου και ψευδής διατηρήθηκαν μόνο με βασική δίαιτα AIN-93G. Μόνο, η ομάδα ινδομεθακίνης έλαβε ινδομεθακίνη (3 mg/kg) ενσωματωμένη στη δίαιτα AIN-93G και η ομάδα A. lappa 300 mg/kg αντιστοιχίστηκε σε δίαιτα AIN-93G συμπληρωμένη με A. lappa (300 mg/kg). Οι θεραπείες συνεχίστηκαν για 24 ημέρες από την ημέρα της επαγωγής της ΟΑ με ρυθμό 15–17 g ανά 190–210 g σωματικού βάρους σε καθημερινή βάση.
2.5. Μέτρηση Βάρος
Μετά την επαγωγή της οστεοαρθρίτιδας, η μέτρηση της ικανότητας μεταφοράς βάρους των πίσω άκρων των αρουραίων πραγματοποιήθηκε με το incapacitance-MeterTester600 (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA) όπως είχε προγραμματιστεί. Η κατανομή βάρους στα πίσω άκρα υπολογίστηκε: ικανότητα φέρουσας βάρους (%)
