Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) είναι μια από τις μακροχρόνιες εκφυλιστικές παθήσεις των οστών και των αρθρώσεων που επηρεάζει τον ηλικιωμένο πληθυσμό άνω των 65 ετών [
1]. Γενικά, οι ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα διαγιγνώσκονται με κατεστραμμένο χόνδρο, φλεγμονή του αρθρικού υμένα και διαβρωμένα χονδροκύτταρα, τα οποία προκαλούν πόνο και σωματική δυσφορία [
2]. Ο αρθριτικός πόνος προκαλείται κυρίως από την εκφύλιση του χόνδρου στις αρθρώσεις λόγω φλεγμονής, και όταν ο χόνδρος έχει υποστεί σοβαρή βλάβη, τα οστά μπορούν να συγκρουστούν μεταξύ τους προκαλώντας αφόρητο πόνο και σωματική κακουχία [
3]. Η εμπλοκή φλεγμονωδών μεσολαβητών σε συμπτώματα όπως πόνος, πρήξιμο και δυσκαμψία της άρθρωσης είναι καλά τεκμηριωμένη. Σε ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα, φλεγμονώδεις κυτοκίνες, οι οποίες προκαλούν διάβρωση του χόνδρου και του υποχόνδριου οστού, βρίσκονται στο αρθρικό υγρό [
4]. Δύο σημαντικά παράπονα που έχουν γενικά οι ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα είναι ο πόνος και η φλεγμονή του αρθρικού υμένα. Επομένως, οι κύριοι στόχοι των τρεχουσών θεραπειών για την οστεοαρθρίτιδα είναι η μείωση του πόνου και της φλεγμονής. [
5]. Παρόλο που οι διαθέσιμες θεραπείες για την οστεοαρθρίτιδα, συμπεριλαμβανομένων των μη στεροειδών και στεροειδών φαρμάκων, έχουν αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα στην ανακούφιση από τον πόνο και τη φλεγμονή, η μακροχρόνια χρήση αυτών των φαρμάκων έχει σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία, όπως καρδιαγγειακές, γαστρεντερικές και νεφρικές δυσλειτουργίες [
6]. Επομένως, πρέπει να αναπτυχθεί ένα πιο αποτελεσματικό φάρμακο με λιγότερες παρενέργειες για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας.
Τα φυσικά προϊόντα υγείας γίνονται ολοένα και πιο δημοφιλή επειδή είναι ασφαλή και εύκολα διαθέσιμα [
7]. Τα παραδοσιακά κορεατικά φάρμακα έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά έναντι αρκετών φλεγμονωδών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της αρθρίτιδας [
8]. Το Aucklandia lappa DC. είναι γνωστό για τις φαρμακευτικές του ιδιότητες, όπως η ενίσχυση της κυκλοφορίας του τσι για την ανακούφιση του πόνου και την καταπράυνση του στομάχου, και έχει χρησιμοποιηθεί παραδοσιακά ως φυσικό αναλγητικό [
9]. Προηγούμενες αναφορές υποδεικνύουν ότι το A. lappa διαθέτει αντιφλεγμονώδη δράση [
10,
11], αναλγητικό [
12], αντικαρκινικό [
13], και γαστροπροστατευτικό [
14] επιδράσεις. Οι διάφορες βιολογικές δράσεις του A. lappa προκαλούνται από τις κύριες δραστικές ενώσεις του: κοστουνολίδη, δεϋδροκοστουνολίδη, διυδροκοστουνολίδη, κοστουσλακτόνη, α-κοστόλη, λακτόνη σαουσουρέας και κοστουσλακτόνη [
15]. Προηγούμενες μελέτες υποστηρίζουν ότι η κοστουνολίδη εμφάνισε αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS), ο οποίος επήγαγε τα μακροφάγα μέσω της ρύθμισης του NF-kB και της οδού πρωτεΐνης θερμικού σοκ [
16,
17]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει διερευνήσει τις πιθανές δράσεις του A. lappa για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας. Η παρούσα έρευνα έχει διερευνήσει τις θεραπευτικές επιδράσεις του A. lappa κατά της οστεοαρθρίτιδας χρησιμοποιώντας μοντέλα τρωκτικών που προκαλούνται από (ιωδοοξικό μονονάτριο) MIA και οξικό οξύ.
Το μονονάτριο-ιωδοξικό (MIA) χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόκληση πολλών από τις συμπεριφορές πόνου και τα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά της οστεοαρθρίτιδας στα ζώα [
18,
19,
20]. Όταν εγχέεται στις αρθρώσεις του γόνατος, η ΜΙΑ διαταράσσει τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων και προκαλεί φλεγμονή και φλεγμονώδη συμπτώματα, όπως διάβρωση του χόνδρου και του υποχόνδριου οστού, τα κύρια συμπτώματα της οστεοαρθρίτιδας [
18]. Η απόκριση συσπάσεων που προκαλείται με οξικό οξύ θεωρείται ευρέως ως η προσομοίωση του περιφερικού πόνου σε ζώα όπου ο φλεγμονώδης πόνος μπορεί να μετρηθεί ποσοτικά [
19]. Η κυτταρική σειρά μακροφάγων ποντικού, RAW264.7, χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη των κυτταρικών αποκρίσεων στη φλεγμονή. Μετά την ενεργοποίηση με LPS, τα μακροφάγα RAW264 ενεργοποιούν φλεγμονώδεις οδούς και εκκρίνουν διάφορους φλεγμονώδεις ενδιάμεσους παράγοντες, όπως TNF-α, COX-2, IL-1β, iNOS και IL-6 [
20]. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τις αντι-αλγαισθητικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις του A. lappa έναντι της οστεοαρθρίτιδας σε ζωικό μοντέλο MIA, ζωικό μοντέλο που προκαλείται από οξικό οξύ και κύτταρα RAW264.7 που ενεργοποιούνται από LPS.
2. Υλικά και Μέθοδοι
2.1. Φυτικό Υλικό
Η αποξηραμένη ρίζα του A. lappa DC. που χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα προμηθεύτηκε από την Epulip Pharmaceutical Co., Ltd., (Σεούλ, Κορέα). Ταυτοποιήθηκε από τον Καθηγητή Donghun Lee, Τμήμα Φυτικής Φαρμακολογίας, Συνταγματάρχη Κορεατικής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Gachon, και ο αριθμός δείγματος κουπονιού κατατέθηκε ως 18060301.
2.2. Ανάλυση HPLC του εκχυλίσματος A. lappa
Το A. lappa εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας συσκευή αναρροής (απεσταγμένο νερό, 3 ώρες στους 100 °C). Το εκχυλισμένο διάλυμα διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας εξατμιστή χαμηλής πίεσης. Το εκχύλισμα A. lappa είχε απόδοση 44,69% μετά από λυοφιλοποίηση στους -80 °C. Η χρωματογραφική ανάλυση του A. lappa διεξήχθη με HPLC συνδεδεμένη χρησιμοποιώντας σύστημα HPLC 1260 InfinityⅡ (Agilent, Pal Alto, CA, ΗΠΑ). Για τον χρωματικό διαχωρισμό, χρησιμοποιήθηκε στήλη EclipseXDB C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Agilent) στους 35 °C. Συνολικά 100 mg του δείγματος αραιώθηκαν σε 10 mL μεθανόλης 50% και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά. Τα δείγματα διηθήθηκαν με φίλτρο σύριγγας (Waters Corp., Milford, MA, ΗΠΑ) 0,45 μm. Η σύνθεση της κινητής φάσης ήταν 0,1% φωσφορικό οξύ (Α) και ακετονιτρίλιο (Β) και η στήλη εκλούστηκε ως εξής: 0–60 λεπτά, 0%· 60–65 λεπτά, 100%· 65–67 λεπτά, 100%· 67–72 λεπτά, 0% διαλύτης Β με ρυθμό ροής 1,0 mL/min. Το έκλουσμα παρατηρήθηκε στα 210 nm χρησιμοποιώντας όγκο έγχυσης 10 μL. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.
2.3. Στέγαση και Διαχείριση Ζώων
Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) ηλικίας 5 εβδομάδων και αρσενικά ποντίκια ICR ηλικίας 6 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Κορέα). Τα ζώα φυλάσσονταν σε δωμάτιο με σταθερή θερμοκρασία (22 ± 2 °C) και υγρασία (55 ± 10%) και κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών. Τα ζώα εξοικειώθηκαν με την κατάσταση για περισσότερο από μία εβδομάδα πριν από την έναρξη του πειράματος. Τα ζώα είχαν ελεύθερη παροχή τροφής και νερού. Οι ισχύοντες κανόνες δεοντολογίας για τη φροντίδα και τον χειρισμό των ζώων στο Πανεπιστήμιο Gachon (GIACUC-R2019003) ακολουθήθηκαν αυστηρά σε όλες τις διαδικασίες πειραματισμού σε ζώα. Η μελέτη σχεδιάστηκε για τυφλή από τον ερευνητή και παράλληλη δοκιμή. Ακολουθήσαμε τη μέθοδο ευθανασίας σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Δεοντολογίας Πειραματικών Ζώων.
2.4. Έγχυση και θεραπεία MIA
Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες, συγκεκριμένα εικονική, ομάδα ελέγχου, ινδομεθακίνη και A. lappa. Έχοντας αναισθητοποιηθεί με μείγμα 2% ισοφθορανίου O2, οι αρουραίοι έλαβαν ενδοαρθρικά 50 μL MIA (40 mg/m²· Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) για να οδηγήσουν σε πειραματική οστεοαρθρίτιδα. Οι θεραπείες διεξήχθησαν ως εξής: οι ομάδες ελέγχου και εικονικής θεραπείας διατηρήθηκαν μόνο με βασική δίαιτα AIN-93G. Μόνο η ομάδα ινδομεθακίνης έλαβε ινδομεθακίνη (3 mg/kg) ενσωματωμένη στη δίαιτα AIN-93G και η ομάδα A. lappa 300 mg/kg έλαβε δίαιτα AIN-93G συμπληρωμένη με A. lappa (300 mg/kg). Οι θεραπείες συνεχίστηκαν για 24 ημέρες από την ημέρα επαγωγής της οστεοαρθρίτιδας με ρυθμό 15-17 g ανά 190-210 g σωματικού βάρους σε ημερήσια βάση.
2.5. Μέτρηση βάρους
Μετά την επαγωγή οστεοαρθρίτιδας, πραγματοποιήθηκε μέτρηση της ικανότητας φέρουσας βάρους των οπίσθιων άκρων των αρουραίων με το incapacitance-MeterTester600 (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρόγραμμα. Η κατανομή βάρους στα οπίσθια άκρα υπολογίστηκε: ικανότητα φέρουσας βάρους (%).
